CRISPR: sådan virker genredigering med Cas9 og guide-RNA

Forestil dig, at du skriver en opgave på tre milliarder bogstaver, og at ét eneste bogstav er forkert. CRISPR gør det muligt at finde netop den fejl og rette den, næsten som funktionen søg og erstat i et tekstprogram. Det er derfor, teknologien i 2020 gav en Nobelpris i kemi.

Til biologieksamen i gymnasiet dukker CRISPR/Cas9 op i alt fra genteknologi til bioetik, og du skal både kunne forklare mekanismen og tage stilling til den. Det kræver, at du forstår, hvorfor et lille RNA-molekyle kan fungere som GPS for et enzym, og hvad der sker, når cellen forsøger at lappe et brud i sit eget DNA. Når de to ting sidder, falder resten på plads.

Hvad er CRISPR?

Bakterier bliver angrebet af virus hele tiden. De virus, der kun angriber bakterier, kaldes bakteriofager, og de er så talrige, at en bakterie sjældent går længe uden at møde dem. Overlever bakterien et angreb, gemmer den et lille stykke af virussens DNA i sit eget genom, mellem nogle gentagne sekvenser. Næste gang samme virus dukker op, kan bakterien genkende den og skære dens DNA over. Det lager af gemte virusstumper og de gentagelser, der omgiver det, er CRISPR.

Forskere har lånt bakteriens system og gjort det til et værktøj. Ifølge Lex' artikel om CRISPR kan metoden ændre alt fra et enkelt nukleotid til større gensekvenser i en levende organisme, og det er et RNA-molekyle, der styrer, hvor i DNA'et det sker. Netop den egenskab er hele pointen. Før CRISPR krævede hvert nyt genredigeringsprojekt, at man byggede et helt nyt protein til målet. Nu skifter man bare det RNA, der peger på målet.

Hvis du er i tvivl om, hvordan gener, DNA og arvelighed hænger sammen, så læs vores gennemgang af genetik først. CRISPR giver mere mening, når du har styr på, hvad et gen egentlig er.

Sådan finder og klipper CRISPR/Cas9 DNA

Hvordan ved et enzym, hvor i tre milliarder basepar det skal klippe? Det gør det ikke. Cas9 er kun saksen. Navigationen klarer guide-RNA'et, et kort RNA-molekyle på cirka 20 nukleotider, hvis baserækkefølge er skrevet, så den passer til målstedet i DNA'et. Et guide-RNA med sekvensen GACGCAUAAAGAUGAGACGC vil for eksempel parre sig med den DNA-streng, der har den komplementære sekvens, ligesom to stykker burrebånd, der kun sidder fast, når de vender rigtigt. Kender du baseparring fra DNA og mRNA, er princippet det samme.

1. 1

   Design guide-RNA'et

   Forskeren vælger en målsekvens i genet og skriver et guide-RNA på cirka 20 nukleotider, der passer til den.

2. 2

   Få komplekset ind i cellen

   Guide-RNA og Cas9 samles til et kompleks og leveres ind i cellen, for eksempel med en plasmid, en virusvektor eller som færdigt protein og RNA.

3. 3

   Cas9 scanner efter PAM

   Cas9 glider langs DNA'et og leder efter en PAM-sekvens. Først når den finder en, åbner den dobbeltspiralen lokalt.

4. 4

   Guide-RNA'et parrer med DNA'et

   Hvis guide-RNA'et passer til sekvensen ved siden af PAM, binder det, og Cas9 skifter form, så den kan klippe.

5. 5

   Cas9 klipper begge strenge

   Enzymet laver et dobbeltstrenget brud cirka tre basepar fra PAM. Nu overtager cellens egen reparation.

PAM-sekvensen er en detalje, mange springer over, men den løser et klogt problem. Bakteriens eget CRISPR-arkiv indeholder jo kopier af virus-DNA, som guide-RNA'et passer perfekt til. Hvorfor klipper Cas9 så ikke i bakteriens eget arkiv? Fordi PAM-sekvensen kun findes i virussens DNA og ikke i selve arkivet. Systemet skelner altså mellem fjende og eget DNA. Forskerne udnytter det samme: uden en PAM i nærheden af målet kan Cas9 ikke klippe, og det begrænser, hvilke steder i genomet der kan redigeres.

Cas9 er desuden kun ét medlem af en hel familie. Cas12 og andre Cas-enzymer bruger lidt andre PAM-sekvenser og klipper på lidt andre måder, så forskere kan vælge det enzym, der passer bedst til det sted i genomet, de vil nå. Det svarer til at have en værktøjskasse med flere sakse i stedet for kun én. Hvilket enzym der bruges, ændrer ikke på grundprincippet: et RNA finder målet, og et enzym klipper.

Et praktisk problem er, hvordan man får saksen ind i cellen. I laboratoriet kan man indsætte en plasmid, der får cellen til selv at lave både Cas9 og guide-RNA, eller man kan levere færdige Cas9-proteiner og guide-RNA direkte. Til behandling af patienter bruges også virusvektorer og små fedtpartikler. Valget har betydning for, hvor længe Cas9 er aktivt i cellen, og jo kortere tid, jo færre chancer for at den klipper det forkerte sted.

Fra bakteriens forsvar til Nobelpris

I 1987 lignede de mærkelige gentagelser i DNA'et fra E. coli mest af alt et biologisk kuriosum. Ingen vidste, hvad de var til. Det tog næsten tyve år, før forskere forstod, at sekvenserne var et immunforsvar, og endnu fem år, før nogen indså, at man kunne bruge det som værktøj. Historien er et godt eksempel på, at grundforskning i bakterier kan ende med at ændre medicinen.

Gennembruddet kom i 2012, da Jinek og kolleger i tidsskriftet Science viste, at to RNA-molekyler fra bakteriens system kan smeltes sammen til ét enkelt guide-RNA. Dermed kunne Cas9 programmeres til at klippe, hvor man ville, blot ved at skrive en ny sekvens. Otte år senere begrundede Nobelkomitéens pressemeddelelse tildelingen af kemiprisen til Charpentier og Doudna med netop denne udvikling.

Hvad sker der efter klippet? NHEJ og HDR

Forestil dig, at du river en side ud af en bog, der er limet i ryggen. Siden skal tilbage, ellers falder bogen fra hinanden. Cellen har det på samme måde med et dobbeltstrenget DNA-brud, og den har to måder at lappe det på. Hvilken af dem den vælger, afgør, hvad forskeren får ud af redigeringen. Klippet i sig selv ændrer nemlig ikke noget. Det er reparationen, der gør.

Den hurtige og lidt sjuskede metode hedder non homologous end joining, forkortet NHEJ. Cellen klistrer de to ender sammen igen uden nogen skabelon. Det går ofte næsten, men ikke helt: der forsvinder eller tilføjes et par nukleotider, en såkaldt indel. Rammer en indel inde i et gen, forskydes aflæsningsrammen, så kodonerne bliver læst forkert i proteinsyntesen, og genet holder som regel op med at virke. Forskere bruger det bevidst, når de vil slå et gen fra, en såkaldt knockout.

Den præcise metode hedder homology directed repair, HDR. Her bruger cellen en skabelon med samme sekvens på begge sider af bruddet. Giver forskeren cellen en kunstig skabelon med en rettet sekvens, kopierer cellen rettelsen ind. HDR kan altså bruges til at rette en mutation eller indsætte et nyt stykke DNA. Til gengæld er den langsommere og virker mest i celler, der er i gang med at dele sig, så det er sværere at få til at ske effektivt.

Fordi et dobbeltstrenget brud i sig selv kan give uønskede ændringer, har forskere udviklet finere varianter. Base editing og prime editing ændrer enkelte nukleotider uden at klippe begge strenge helt over. Tænk på det som en blyant med viskelæder frem for en saks. Teknikkerne er nyere og mere præcise, men grundideen er den samme: et guide-RNA peger, og et enzym udfører.

Hvorfor blev CRISPR hurtigt standard i laboratorier?

Genredigering fandtes før CRISPR. Zinkfingernukleaser og TALEN-enzymer kunne også klippe i DNA på et bestemt sted. Problemet var, at hvert nyt mål krævede, at forskerne konstruerede et helt nyt protein, som skulle genkende netop den sekvens. Det var tidskrævende, dyrt og svært at gøre i stor skala. Med CRISPR er proteinet det samme hver gang, og det er kun guide-RNA'et, der skal skiftes. Et RNA på 20 nukleotider kan bestilles og leveres på få dage.

Den lave trærskel har fået konsekvenser. Flere laboratorier kan nu teste mange gener på én gang, og forskere kan lave et bibliotek af guide-RNA'er, der hver især slår ét gen fra i en cellekultur. Man kan derefter se, hvilke gener der er nødvendige for, at en kræftcelle overlever, eller for at et virus kan angribe en celle. Netop den type screening er blevet en af de mest brugte anvendelser af CRISPR i grundforskning.

CRISPR er dog ikke perfekt. Cas9 kan kun klippe, hvor der ligger en PAM, nogle steder i genomet er svære at komme til, og off target effekter kan ikke udelukkes helt. Cellens egen reparation er også svær at styre, så NHEJ og HDR sker ikke i den ønskede fordeling hver gang. Det er derfor, forskere stadig arbejder på at gøre metoden mere præcis, og derfor, at hver ny behandling skal igennem lange kliniske studier, før den kommer til patienter.

CRISPR og sygdomme: fra laboratorium til patient

Seglcelleanæmi er et af de tydeligste eksempler på, hvor stor forskel ét enkelt nukleotid kan gøre. I genet for betaglobin er kodonet GAG, som koder for glutaminsyre, blevet til GTG, som koder for valin. Hæmoglobinet klumper sig sammen ved iltmangel, de røde blodlegemer bliver segllignende, og det giver smertefulde kriser. Spørgsmålet er, hvordan en forsker ville gribe det an med CRISPR.

Den første godkendte CRISPR-behandling vælger en anden vej end at rette selve mutationen. Ifølge Det Europæiske Lægemiddelagenturs vurdering af Casgevy tager lægerne patientens egne bloddannende stamceller, redigerer dem uden for kroppen i en enhancer-region i genet BCL11A og giver dem tilbage. Redigeringen får kroppen til at danne mere føtalt hæmoglobin, som kan transportere ilt, selv om det voksne hæmoglobin er defekt. I det studie, EMA bygger på, var 28 af 29 patienter med seglcelleanæmi frie for smertekriser i mindst 12 måneder i træk.

Det er en engangsbehandling, men ingen hurtig løsning. Patienterne skal følges i 15 år for at kontrollere langtidseffekt og sikkerhed, og EU-godkendelsen er betinget, indtil de endelige studieresultater foreligger. Forskere arbejder også på CRISPR-baserede metoder mod blandt andet visse kræftformer og arvelige øjensygdomme, men det meste er stadig på forsøgsstadiet.

Forskellen mellem at redigere celler uden for kroppen og inde i kroppen er værd at kende. Ved ex vivo redigering, som i Casgevy, tager man cellerne ud, redigerer dem og tjekker dem, før de gives tilbage. Man kan altså kontrollere resultatet, inden patienten får behandlingen. Ved in vivo redigering sendes CRISPR-komponenterne ind i kroppen og skal finde de rigtige celler selv. Det er sværere at kontrollere, men det kan i princippet nå organer, hvor man ikke kan tage cellerne ud, som lever eller øjne.

CRISPR, GMO og rekombinant DNA

Er CRISPR det samme som GMO? Svaret er både ja og nej, og netop derfor stiller lærere spørgsmålet så ofte. Klassisk genteknologi bygger på rekombinant DNA: man tager et gen fra én art, sætter det ind i en plasmid eller anden vektor og får det ind i en anden organisme. Resultatet er en transgen organisme med fremmed DNA. CRISPR kan gøre det samme, hvis man giver cellen en skabelon med et fremmed gen, men metoden kan også bare ændre en enkelt base i organismens eget gen.

Forskellen betyder noget juridisk. EU-Domstolen afgjorde i 2018, at organismer fremstillet med nyere mutagenesemetoder som CRISPR som udgangspunkt er omfattet af reglerne for genmodificerede organismer. Reglerne diskuteres fortsat politisk i EU, så tjek den nyeste status, hvis du skriver opgave om emnet. En god baggrund finder du i Lex' artikel om genteknologi.

I landbruget forsker man blandt andet i afgrøder, der tåler tørke, og planter, der er mere modstandsdygtige over for svampesygdomme. Argumentet for er, at mindre sprøjtegift og højere udbytte kan hjælpe både miljø og fødevaresikkerhed. Argumentet imod er, at ændringer i naturen kan have konsekvenser, vi ikke har overblik over, og at store firmaer kan få patent på sorter, som landmænd bliver afhængige af.

CRISPR bruges også langt ude af syne for almindelige forbrugere. I grundforskning slår forskere gener fra i mus, fluer og cellekulturer for at se, hvad der sker, når et gen mangler. Den slags forsøg har gjort det hurtigere at finde ud af, hvad enkelte gener gør, og hvordan sygdomme opstår. Her er etikken enklere end ved mennesker, men dyreforsøg rejser stadig spørgsmål om dyrevelfærd, som du kan trække ind i en diskussion.

Etik: hvor går grænsen?

Der er stor forskel på at rette en defekt i en patients blodceller og at rette den i et befrugtet æg. Ændrer du i somatiske celler, som blodets stamceller, gælder ændringen kun for den ene person og bliver ikke givet videre. Ændrer du i kønsceller eller et embryo, ender ændringen i alle kroppens celler og kan nedarves til kommende generationer. Den skelnen er det vigtigste redskab, du har i en etisk diskussion af CRISPR.

I 2018 meddelte den kinesiske forsker He Jiankui, at han havde redigeret embryoner, så der var født tvillingepiger. Meddelelsen blev mødt af bred international kritik, fordi teknologien ikke var sikker nok, og fordi ingen kunne vide, hvordan ændringerne ville påvirke pigerne senere i livet. Han blev i 2019 idømt tre års fængsel i Kina.

Tilhængere af at redigere kønsceller peger på, at en sygdom som Huntingtons kunne forsvinde ud af en slægt. Kritikere spørger, hvem der afgør, hvad der er en sygdom, og hvad der blot er en ønsket egenskab, og om teknologien ender som et privilegium for dem med penge. Så er der den tekniske usikkerhed. Off target effekter betyder, at guide-RNA'et kan klippe på et forkert sted, og i et embryo kan ikke alle celler blive redigeret ens, så barnet får en blanding af redigerede og uredigerede celler.

Spørgsmålet om samtykke gør det ekstra svært. Et embryo kan ikke sige til eller fra, og de fremtidige generationer, der arver ændringen, kan slet ikke blive spurgt. Derfor har mange lande forbud eller strenge regler mod at redigere arvelige ændringer i mennesker, og forskere har gentagne gange efterlyst en bred offentlig debat, før nogen går videre. Når du argumenterer, så husk at forklare, hvilket værdigrundlag dit argument bygger på: Handler det om konsekvenser, om rettigheder eller om menneskers værdighed?

Til eksamen scorer du højt på at skelne mellem terapi og forbedring og mellem somatisk og kønscelleredigering, og på at bruge etiske argumenter frem for mavefornemmelser. Hvis du sidder fast i genteknologien, kan en tutor i biologi gennemgå emnet med dig, så du føler dig sikker, før du skal op.

Typiske fejl om CRISPR

Netop fordi CRISPR bygger på flere samarbejdende dele, er der nogle misforståelser, der går igen i opgaver og til mundtlig eksamen. Tjek, om du har dem.